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為什么用無水乙醇沉淀試劑的DNA?
更新時間:2020-03-02   點擊次數:9586次

★ 用無水乙醇沉淀DNA,這是實驗中用的沉淀DNA的方法。乙醇的優點是可以任意比和水相混溶,乙醇與核酸不會起任何化學反應,對DNA很安全,因此是理想的沉淀劑。

DNA溶液是DNA以水合狀態穩定存在,當加入乙醇時,乙醇會奪去DNA周圍的水分子,使DNA失水而易于聚合。一般實驗中,是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合,其乙醇的終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來替代無水乙醇(因為無水乙醇的價格遠遠比95%乙醇昂貴)。

但是加95%的乙醇使總體積增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA損失也增大,尤其用多次乙醇沉淀時,就會影響收得率。

折中的做法是初次沉淀DNA時可用95%乙醇代替無水乙酵,后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15-30分鐘即可。

★ 在用乙醇沉淀DNA時,為什么一定要加NaAc或NaCl至終濃度達0.1~0.25mol/L?

在pH為8左右的溶液中,DNA分子是帶負電荷的,加一定濃度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的負電荷,減少DNA分子之間的同電荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀,當加入的鹽溶液濃度太低時,只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合。

這樣就造成DNA沉淀不*,當加入的鹽溶液濃度太高時,其效果也不好。在沉淀的DNA中,由于過多的鹽雜質存在,影響DNA的酶切等反應,必須要進行洗滌或重沉淀。

★ 加核糖核酸酶降解核糖核酸后,為什么再要用SDS與KAc來處理?

加進去的RNase本身是一種蛋白質,為了純化DNA,又必須去除之,加SDS可使它們成為SDS-蛋白復合物沉淀,再加KAc使這些復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽形式的SDS-蛋白質復合物,使沉淀更加*。也可用飽和酚、氯fang抽提再沉淀,去除RNase。在溶液中,有人以KAc代替NaAc,也可以收到較好效果。

★ 為什么在保存或抽提DNA過程中,一般采用TE緩沖液?

在基因操作實驗中,選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩定性及緩沖液成分不產生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(pKa=7.2)和硼酸系統(pKa=9.24)等雖然也都符合細胞內環境的生理范圍(pH),可作DNA的保存液,但在轉化實驗時,磷酸根離子的種類及數量將與Ca2+產生Ca3(PO4)2沉淀。

在DNA反應時,不同的酶對輔助因子的種類及數量要求不同,有的要求高離子濃度,有的則要求低鹽濃度,采用Tris-HCl(pKa=8.0)的緩沖系統,由于緩沖液是TrisH+/Tris,不存在金屬離子的干擾作用,故在提取或保存DNA時,大都采用Tris-HCl系統,而TE緩沖液中的EDTA更能穩定DNA的活性。

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