目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實驗室使用時對所提供的濃縮液稀釋配制，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應保證質量。zui為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。這樣做的目的，所以有時候一份標本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。加在孔壁上部的非包被區，易導致非特異吸附。其次，主要是為了在后面，能使反應微孔內的溫度能較快地達到所要求的高度，以知足測定要求。
再如治療藥物的檢測，應根據藥代動力學選擇服藥后的zui適時間抽血檢測。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。使用微量加樣器加樣必需留意的樞紐點是：ELISA試劑盒加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產氣憤泡。對用于激素和治療藥物測定的血清標本的收集，要留意收集時間甚或體位有可能會對測定結果產生影響。
結果判定和結果講演及解釋等方面，其中任一步驟的不當都會影響測定結果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。濺出會對臨近孔產生污染。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物和特種蛋白等的檢測的血清標本的收集則沒有時間和體位方面的影響。ELISA試劑盒作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結合反應在固相長進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結合，必需在一定的溫度前提下反應一定的時間。
